CRISPR－Cas9以基因定位的簡單性、靈活性和準(zhǔn)確性，叩響了輔助生殖技術(shù)的大門，未來的發(fā)展，有賴于更多的突破性決策 。
CRISPR－Cas9以基因定位的簡單性、靈活性和準(zhǔn)確性，叩響了輔助生殖技術(shù)的大門，如何看待、接納和扶持這一新興技術(shù)考驗(yàn)國人乃至全人類的智慧。
任何關(guān)于人類胚胎CRISPR基因編輯的消息都受到媒體的廣泛報道，學(xué)術(shù)界的熱度也絲毫不弱，世界范圍內(nèi)的科學(xué)家現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)表了八篇人類胚胎中的基因編輯的相關(guān)研究報告，其中五篇發(fā)表在過去三個月。
2017年下半年更是密集。8月2日、9月23日、10月5日，美、中、英的學(xué)者各自在《Nature》《Protein＆Cell1》和《Nature》上發(fā)表論文，引起了更多的討論，因?yàn)樗砹薈RISPR在糾正致病突變基因和人類胚胎中精準(zhǔn)基因功能調(diào)控的方法學(xué)上又邁出了一步。
但是，這距離我們的最終目標(biāo)，即通過基因編輯來精準(zhǔn)且徹底地糾正致病突變基因，理解人類胚胎基因調(diào)控還有多遠(yuǎn)，三篇文章提出了更新的問題。在我們考慮對生殖系細(xì)胞進(jìn)行基因編輯的臨床應(yīng)用之前，還需要更多、更嚴(yán)謹(jǐn)且周密的實(shí)驗(yàn)。
作為生殖生物學(xué)工作者，我們有能力了解本領(lǐng)域的最新研究結(jié)果，同時，我們也有義務(wù)盡可能公開、準(zhǔn)確地進(jìn)行討論基因編輯對于輔助生殖技術(shù)/醫(yī)學(xué)的推動及其未來的應(yīng)用前景。
CRISPR-Cas9的優(yōu)勢和局限
引起基因編輯的真正革命，是通過引入CRISPR-Cas系統(tǒng)，其中，一種核酸酶Cas9起了主要作用。
在普通的基因治療中，患病細(xì)胞和組織中的基因可以通過兩種方法進(jìn)行修正：體內(nèi)編輯和離體編輯。體內(nèi)編輯治療涉及將基因編輯試劑，如可編程核酸酶和供體模板直接轉(zhuǎn)移到人體中。相比之下，在離體治療中，將靶細(xì)胞群體從體內(nèi)移出，使用可編程核酸酶修飾，然后移植回原宿主體，從而防止由免疫排斥引起的并發(fā)癥。
輔助生殖技術(shù)中固有的體外受精、早期胚胎培養(yǎng)和發(fā)育，有6天－7天的過程，均發(fā)生在體外的離體環(huán)境。CRISPR-Cas9基因編輯在輔助生殖技術(shù)中的潛在的技術(shù)碰撞與融合，無疑將充滿無限空間供人類憧憬與遐想。不過，將基因編輯技術(shù)前所未有地引入人類胚胎的安全性值得特別關(guān)注。盡管這些妙處令人垂涎，但其系統(tǒng)固有的局限性也清晰可見。首先是脫靶效應(yīng)。
將基因編輯技術(shù)前所未有地引入人類胚胎的安全性值得特別關(guān)注。因?yàn)樗谢蚓庉嫻ぞ叨际强删幊痰暮怂崦?，如果設(shè)計的核酸酶一旦脫靶，有可能另外一個基因被誘發(fā)突變，導(dǎo)致可能與靶基因突變預(yù)期的結(jié)果混淆的效應(yīng)或表型，這樣的意外的脫靶突變可能導(dǎo)致細(xì)胞癌變或喪失功能。當(dāng)使用培養(yǎng)的細(xì)胞而不是胚胎時，脫靶事件不太成問題，因?yàn)楹Y除脫靶誘發(fā)的突變細(xì)胞系是可行的。
然而，輔助生殖技術(shù)的對象就是生殖細(xì)胞或胚胎，其遺傳修飾是永久性的，而且會遺傳給下一代。因此，目前正在進(jìn)行的多項(xiàng)研究工作都致力于減少脫靶效應(yīng)。
第二是嵌合體問題。當(dāng)使用基因編輯技術(shù)時，出現(xiàn)嵌合體和不完全的基因組靶向編輯是相當(dāng)普遍的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)CRISPR基因編輯系統(tǒng)更適用處于細(xì)胞分裂時期的細(xì)胞進(jìn)行基因組修飾。CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)應(yīng)用于輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域同樣伴隨著脫靶效應(yīng)及胚胎細(xì)胞的嵌合體問題，這樣可能會影響到移植胚胎的基因表達(dá)及嬰兒的健康。
生殖系基因編輯后的臨床風(fēng)險評估復(fù)雜且困難?？傮w看，在胚胎移植和隨后的懷孕階段，使用羊膜穿刺或絨毛活檢的臨床管理可以進(jìn)一步檢測基因編輯結(jié)果。因此，進(jìn)行基因編輯的有利之處將可能大于風(fēng)險。而事實(shí)上，由于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中可能存在的染色體嵌合，生殖醫(yī)學(xué)可能無法百分之百防止某些遺傳疾病在后代發(fā)生。以至于出生后，兒童期或成年期后可能仍然受到遺傳疾病影響。
基因編輯技術(shù)的臨床應(yīng)用
世界范圍內(nèi)大約六分之一的夫婦會遇到與不孕相關(guān)的問題。基因編輯可以幫助挽救突變胚胎，增加移植的健康胚胎數(shù)量，最終提高妊娠率為目的。遺憾的是，我們還不太清楚調(diào)節(jié)人類胚胎細(xì)胞的機(jī)制，著床前胚胎正常發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制對輔助生殖技術(shù)的影響。
發(fā)育生物學(xué)家對控制小鼠胚胎著床前發(fā)育的基因和機(jī)制進(jìn)行了深入的了解，然而，由于小鼠基因組與人類基因組相比序列上有顯著差異，二者胚胎著床前發(fā)育和多能性之間也有顯著差異，同時越來越多的研究使我們意識到，通過胚胎著床前小鼠發(fā)育的遺傳研究產(chǎn)生的豐富知識并不容易直接應(yīng)用到人類胚胎。
最近一個英國研究團(tuán)隊(duì)用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯，研究人類胚胎發(fā)育過程中發(fā)育多能性轉(zhuǎn)錄因子OCT4基因的功能，同時通過導(dǎo)向RNA靶向誘導(dǎo)人類胚胎干細(xì)胞的小鼠受精卵顯微注射來誘導(dǎo)OCT4基因突變，來確定OCT4基因發(fā)育過程中的功能。結(jié)果顯示，小鼠胚胎保持了其源于共同祖先的基因表達(dá)，并且胚胎可以發(fā)育到囊胚。這表明，OCT4基因功能喪失在人和小鼠胚胎中具有不同的后果。
世界范圍內(nèi)有超過1萬種單基因遺傳疾病，這是由DNA中單個基因的單一錯誤引起的。如β-地中海貧血、鐮狀細(xì)胞病和1型脊髓性肌萎縮等。目前輔助生殖移植前，基因診斷（PGD）技術(shù)已經(jīng)可成功預(yù)防這些遺傳疾病，成為防止常染色體顯性遺傳疾病的唯一方法。
PGD于1989年首次被引入生殖醫(yī)學(xué)。嚴(yán)格意義上講，PGD不是輔助生殖技術(shù)。它只是一個診斷程序，可以診斷特定胚胎是否攜帶單個突變基因而已，而非糾正胚胎攜帶遺傳變異基因的治療手段。
例如，在亨廷頓病和型神經(jīng)纖維瘤病攜帶者中，即便準(zhǔn)父母只有一方攜帶該常染色體顯性突變基因，其后代也有50％的發(fā)病幾率。一種更極端的情況是，當(dāng)準(zhǔn)父母中一方攜帶常染色體顯性突變基因?yàn)榧兒献訒r，傳播給后代的風(fēng)險高達(dá)100％，因此借助于輔助生殖技術(shù)無法獲得無突變的胚胎。
PGD無效的另一種情況是準(zhǔn)父母雙方含常染色體隱性突變基因均為純合子，意味著它們都攜帶兩個等位致病基因。在這種情況下，基因編輯可作為PGD的替代方案，為一些準(zhǔn)父母輔助生殖技術(shù)的新選項(xiàng)，如在胚胎移植前，對精子、卵子，或試管受精產(chǎn)生的胚胎均可以進(jìn)行突變基因的修復(fù)。最后，基因編輯技術(shù)可以對攜帶線粒體基因突變卵母細(xì)胞和胚胎的線粒體DNA突變通過基因編輯來糾正線粒體基因突變。對此，PGD作為遺傳基因的診斷技術(shù)則完全束手無策。
美國哈佛大學(xué)David R. Liu團(tuán)隊(duì)2016在《自然》發(fā)表了具劃時代意義的糾正基因突變的替代方法。新方法不需要誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂即可糾正基因組DNA中的點(diǎn)突變，暨“堿基編輯” 技術(shù)，可以直接、不可逆地將單一DNA堿基轉(zhuǎn)換為另一個堿基，且不需要DNA主鏈切割或供體模板。2017年10月25日Broad研究所教授、華人學(xué)者David Liu在《自然》上發(fā)表了第七代 “堿基編輯器” ， 即腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)（ABE）。該系統(tǒng)只要通過對DNA的堿基進(jìn)行原子重排，無需使DNA斷裂，就能完成基因的精準(zhǔn)編輯，促進(jìn)遺傳疾病的研究和治療。在矯正單堿基突變方面，它比CRISPR-Cas9系統(tǒng)更為有效，也更“干凈”。排除了能引起任何隨機(jī)插入和刪除等突變的可能性，在全基因組里的脫靶效應(yīng)也要好于CRISPR-Cas9技術(shù)。
9月23日中山大學(xué)的一個研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表在《Protein＆Cell1》上的論文顯示，他們成功地將“堿基編輯”技術(shù)精確地應(yīng)用于糾正人類胚胎中的β-地中海貧血，證明了在人編輯系統(tǒng)體細(xì)胞和克隆移胚胎（模擬純合突變疾病胚胎）中治愈遺傳疾病的可行性。
當(dāng)PGD需要選擇胚胎時，CRISPR更類似于治療，是預(yù)防性的“先發(fā)制人”的治療方法。
作為選擇性技術(shù)的PGD（目前）和治療性技術(shù)的CRISPR（可能在未來）是兩種可以實(shí)現(xiàn)類似目的的技術(shù)：在這兩種情況下，這些技術(shù)增加了父母遺傳相關(guān)后代不受特定遺傳條件影響的機(jī)會。
未來展望
CRISPR-Cas9可通過去除和替代有缺陷的基因，例如血友病、癌癥、1型糖尿病，來治療和預(yù)防疾病。這種干預(yù)措施不僅可以改善患者的生活質(zhì)量和持續(xù)時間，而且還可以挽救家庭，減緩政府和醫(yī)療機(jī)構(gòu)所承受的巨額藥物、康復(fù)服務(wù)等的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
據(jù)經(jīng)濟(jì)學(xué)家估計，2016年到2024年，全球植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）市場年均復(fù)合增長率為6.2％－6.3％。中國對胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)篩查和診斷潛在市場約80億－100億元?？梢娀蚓庉媽GD的潛在替代作用、研發(fā)和市場擴(kuò)張，必將為未來幾年的市場提供發(fā)展空間和廣闊的經(jīng)濟(jì)前景。
對于變異基因攜帶者夫婦或個人，將變異基因傳播給下一代風(fēng)險是他們不得不正視的挑戰(zhàn)。世界范圍內(nèi)，由于地域、文化、宗教、法律，乃至國情的差異，這一群體在避免將變異基因傳播給下一代方面，可以有多樣化的選擇。
俄勒岡美國國家靈長類研究中心Shoukrat Mitalipov團(tuán)隊(duì)最近在《自然》上發(fā)表他們的研究結(jié)果。他們認(rèn)為，基因編輯可能對植入前遺傳學(xué)診斷有補(bǔ)充作用來糾正人類胚胎中的遺傳突變。科學(xué)家們能夠在72％的胚胎中成功糾正突變的基因。研究人員假設(shè)，可能有一種以前未知的細(xì)胞分子生物學(xué)機(jī)制參與CRISPR糾正突變的基因，用來自卵母細(xì)胞的基因的“健康”DNA替代攜帶該突變的基因。如果此假設(shè)存在，這一基因編輯糾正突變基因后留給子代的基因組將無“非自然”成分。因?yàn)檫@種形式的遺傳編輯可以留下處于自然遺傳狀態(tài)的野生型基因，將會更容易被公眾接受。
然而，通過基因編輯雖可實(shí)現(xiàn)避免缺陷嬰兒出生，增進(jìn)人類健康等積極作用，但同時也對生命、人格尊嚴(yán)構(gòu)成挑戰(zhàn)。因而嚴(yán)格行業(yè)內(nèi)監(jiān)管與質(zhì)量控制，是政府職能部門面臨的新挑戰(zhàn)。目前尚不能清楚地概述基因編輯技術(shù)應(yīng)用于輔助生殖技術(shù)相關(guān)的所有潛在的監(jiān)管問題，但主要應(yīng)當(dāng)著眼于安全性、有效性和質(zhì)量控制。美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）和歐洲藥品管理局(EMA) 發(fā)布的基因和細(xì)胞治療的質(zhì)量控制相關(guān)指導(dǎo)可資借鑒。
從安全角度看，在人類基因編輯應(yīng)用于輔助生殖技術(shù)或生殖系細(xì)胞基因編輯之前，所需的最低要求應(yīng)該是，定義廣泛接受的人類基因編輯方法的定義，測定和監(jiān)測非目標(biāo)誘變的最低標(biāo)準(zhǔn)；關(guān)于人類基因編輯造成脫靶突變產(chǎn)生的可能影響共識，制定可接受脫靶突變的最大閾值；關(guān)于可接受的基因編輯類型對于其潛在的意想不到的后果的共識。
應(yīng)依據(jù)該技術(shù)應(yīng)用的不同類型明確監(jiān)管的權(quán)威機(jī)構(gòu)，并需完善操作環(huán)節(jié)的技術(shù)規(guī)范。
在2015年初，中國科學(xué)家率先使用CRISPR-Cas9對人類不能正常發(fā)育到期受精卵進(jìn)行基因編輯，刺激了許多科學(xué)家和組織澄清他們對使用編輯方法的立場，導(dǎo)致世界范圍內(nèi)對基因編輯技術(shù)已經(jīng)表達(dá)了各種各樣的關(guān)切。英國和瑞典都準(zhǔn)許從事人類胚胎基因組編，但不包括植入胚胎的實(shí)驗(yàn)。在英國，人類受精和胚胎管理局（HFEA）批準(zhǔn)了倫敦弗朗西斯克里克研究所的發(fā)育生物學(xué)家凱西·尼亞坎（Kathy Niakan）在健康人體胚胎中使用CRISPR-Cas9的應(yīng)用。
美國國家科學(xué)院（NAS）和美國國家醫(yī)學(xué)研究院（NAM）的立場是，如果基因編輯目的是治療或預(yù)防嚴(yán)重的遺傳疾病，而且基因編輯該程序被證明是安全的，那么使用諸如CRISPR－Cas9的基因編輯技術(shù)來糾正生殖系細(xì)胞嚴(yán)重的遺傳基因突變則可以接受。
2017年8月3日，在美國人類遺傳學(xué)雜志聯(lián)合具有遺傳學(xué)專業(yè)知識的11個團(tuán)體和國際組織發(fā)表了聯(lián)合立場聲明，闡述了人類生殖系細(xì)胞基因編輯問題的三個關(guān)鍵立場：第一，在科學(xué)、倫理和政策的諸多問題尚未有答案或取得共識的情況下，目前，以懷孕為目的進(jìn)行生殖系細(xì)胞基因編輯是不合適的。
第二，為了基因編輯應(yīng)用于未來臨床服務(wù)，當(dāng)下只要有效監(jiān)督并得到捐助者的知情同意，沒有理由禁止人類胚胎和配子的體外生殖系細(xì)胞基因編輯，也不應(yīng)該禁止公共資金對此類研究項(xiàng)目資助。
第三是人類生殖系細(xì)胞基因編輯的未來臨床應(yīng)用不應(yīng)該進(jìn)行，除非存在（a）令人信服的醫(yī)學(xué)理由，（b）支持其應(yīng)用于臨床的證據(jù)基礎(chǔ)，（c）道德上的理由，以及（d）公開透明的程序征得利益攸關(guān)方的意見。
與此同時，基因編輯治療引起了國際制藥公司的極大興趣，2017年10月12日美國一家致力于挑戰(zhàn)遺傳疾病基因治療公司Spark Therapeutics宣布，F(xiàn)DA和基因治療咨詢委員會一致推薦批準(zhǔn)LUXTURNA（voretigene neparvovec）用于治療由確認(rèn)的雙側(cè)RPE65介導(dǎo)的遺傳性視網(wǎng)膜引起的視力喪失患者疾?。↖RD）。這是首款研究性的潛在具有一次性基因編輯治療的藥物。
在CRISPR－Cas9基因編輯時代，我們可能會期待更多這樣的突破性決策，因?yàn)镃RISPR－Cas9以基因定位的簡單性、靈活性和準(zhǔn)確性，叩響了輔助生殖技術(shù)的大門，如何看待、接納和扶持這一新興技術(shù)考驗(yàn)國人乃至全人類的智慧。