【臨床研究】浮游器篩選后精子超微結(jié)構(gòu)變化和IVF-ET結(jié)局分析：一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)
作者：
曹曉敏 劉麗 邸建永 劉燁 張美姿 徐鳳琴
作者單位：
天津市第一中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科 300192
通信作者：
徐鳳琴，Email：xufengqin1968@126.com，電話：+86-13652169698
摘要
目的 尋找體外受精（in vitro fertilization，IVF）過(guò)程中合適的精液處理方法。
方法 本研究采用前瞻性隨機(jī)對(duì)照雙盲設(shè)計(jì)，選取300例因女性因素且男性生育力檢查未見異常行IVF-胚胎移植（embryo transfer，ET）助孕的不孕夫婦為研究對(duì)象，納入的患者通過(guò)計(jì)算機(jī)產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)進(jìn)行隨機(jī)化分組，分為浮游組（新型無(wú)損傷精子篩選技術(shù)，F(xiàn)Y組，n=100）、密度梯度組（DG組，n=100）和上游組（SU 組，n=100）。收集三組患者受精后剩余的精子觀察精子超微結(jié)構(gòu)，并比較三組優(yōu)選后精子DNA 碎片指數(shù)（DNA fragment index，DFI）及IVF-ET治療過(guò)程中的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及妊娠率等指標(biāo)之間的差異。
結(jié)果 FY組精子DFI顯著低于DG組和SU組（3.22%±2.73%比8.31%±2.14%比6.43%±2.56%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02），F(xiàn)Y 組的精子頭、尾部質(zhì)膜完整率明顯高于其他兩組（92.0%±24.2%比80.2%±29.5% 比 73.2%±30.1%和93.9%±1.2%比80.1%±1.1%比74.9%±1.2%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01，P=0.03）。FY組的優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率明顯高于DG組和SU組［44.14% （452/1024）比32.30%（292/904）比32.46%（296/912）和54.40%（396/728）比43.52%（302/694）比46.34% （330/712）］，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.001）。新鮮周期FY組的妊娠率和植入率明顯高于DG組和SU組［57.14%（24/42）比 33.33%（16/48）比35.56%（16/45）和 50.00%（30/60）比27.45%（14/51）比 28.26%（13/46）］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.04，P=0.02）。復(fù)蘇周期FY組的妊娠率和植入率明顯高于DG組和SU組［52.38%（22/42）比 31.25%（10/32）比 37.14%（13/35）和52.38%（22/42）比29.41%（10/34）比30.56%（11/36）］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.03，P=0.02）。
結(jié)論 浮游法可減少對(duì)精子造成的物理?yè)p傷，提高精子質(zhì)膜的完整率，降低精子DFI，改善輔助生殖技術(shù)結(jié)局。
【關(guān)鍵詞】密度梯度法；上游法；精子超微結(jié)構(gòu)；受精，體外；胚胎移植；精子優(yōu)選；浮游法
基金項(xiàng)目：天津市第一中心醫(yī)院院內(nèi)春風(fēng)科研基金（院CF201810）
DOI：10.3760/cma.j.cn101441-20200508-00266
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自1978年世界上第一例試管嬰兒誕生后輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology， ART）在全球快速普及，解決了許多不孕患者的生育問(wèn)題，但臨床數(shù)據(jù)報(bào)道ART治療效率并不高。2018年美國(guó)、歐洲生殖與不孕協(xié)會(huì)報(bào)道每個(gè)移植胚胎的妊娠率和活產(chǎn)率分別為37%和25%［1-2］。這種低效率與多種因素有關(guān)，除了精子本身受精功能障礙或卵子異常外，精子體外處理方法的選擇和效果也是重要的原因之一。因此從精液中篩選出活力、形態(tài)、受精潛能最優(yōu)的精子是ART的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的密度梯度法和上游法篩選精子過(guò)程包括離心和數(shù)次的洗滌操作，離心后精液中活性氧急劇增高，使得攜帶變性DNA的精子比例增加［3］，含有DNA碎片的精子可能具有使卵子受精的能力，但對(duì)胚胎發(fā)育會(huì)造成影響，引起胚胎發(fā)育減慢、甚至早期死亡［4］。處理過(guò)程中多次離心也會(huì)對(duì)精子的細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成損傷，精子的質(zhì)膜是最容易損傷的部位，精子單位膜完整性遭到破壞將會(huì)影響精子正常的新陳代謝、受精、卵裂和胚胎發(fā)育［5］。上游法對(duì)精液質(zhì)量有所限制，只適用于優(yōu)選精液質(zhì)量好的標(biāo)本，而且回收效率低。綜上，目前胚胎實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的精子制備技術(shù)尚不完善，處理過(guò)程無(wú)法避免對(duì)精子造成醫(yī)源性的損傷。
精子浮游器是模擬女性體內(nèi)對(duì)精子的自然篩選過(guò)程，浮游管內(nèi)含造型類似宮頸的粉紅色通液孔，使精子直接從液化精液中上游到培養(yǎng)液中，跨過(guò)浮游通孔的上緣進(jìn)入凹槽內(nèi)，不經(jīng)歷密度梯度、離心和洗滌等過(guò)程，富集最優(yōu)的精子用于體外受精（in vitro fertilization， IVF），該方法理論上可替代密度梯度法和上游法處理精液標(biāo)本，該方法是否適合少弱精子、附睪精子等標(biāo)本的處理目前尚無(wú)數(shù)據(jù)發(fā)表。精子浮游器是海外資深的專業(yè)人士研發(fā)的一款用于精液優(yōu)化的專利產(chǎn)品，并于2019年在中國(guó)成功獲批輔助生殖耗材產(chǎn)品注冊(cè)證，開始投入市場(chǎng)使用。我科室率先使用了該產(chǎn)品，目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。
為深入了解浮游器與本中心主流使用的密度梯度法和上游法優(yōu)化后精子的差別，本研究借助透射電子顯微鏡技術(shù)對(duì)精子頭膜系統(tǒng)、頂體、軸絲、尾部質(zhì)膜等進(jìn)行觀察，對(duì)比三種精液處理方法優(yōu)化后精子細(xì)微結(jié)構(gòu)和精子DNA碎片指數(shù)（DNA fragment index，DFI）等的差異，并比較三種方法處理后精子的受精和胚胎發(fā)育情況及胚胎移植后的臨床結(jié)局信息。
一.
研究對(duì)象
選取2018年12月至2020年4月期間就診于天津市第一中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科的因女性因素及不明原因不孕的夫婦作為研究對(duì)象，包括盆腔及輸卵管因素、排卵障礙、3次以上夫精宮腔內(nèi)人工授精（intrauterine insemination，IUI）未孕、子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征等。男方生育力未見異常，收集輔助生殖治療周期受精后剩余的精子。樣本量的計(jì)算公式為n=［PA（1-PA）+PB（1-PB）］［Z1-α/（2τ）+Z1-βPA-PB］2，其中PA為精子浮游器法的研究對(duì)象妊娠率，估計(jì)值0.55，PB為密度梯度法/上游法的研究對(duì)象妊娠率，估計(jì)值0.4，α為一類錯(cuò)誤的概率，值為0.05，β為二類錯(cuò)誤的概率，值為0.25，Z為正態(tài)分布相應(yīng)概率下的Z值，τ為組間比較的次數(shù)，值為2，本研究所需樣本量為276，考慮到研究中可能存在研究對(duì)象的脫落，本研究最終樣本量為300。本研究經(jīng)天津市第一中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018N147KY），所有患者均簽署知情同意書并自愿參加本研究。
二.
納入、排除標(biāo)準(zhǔn)和分組
納入標(biāo)準(zhǔn)：男方禁欲3~5 d后取卵日采集的精液，激素檢查［卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone， FSH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、泌乳素和睪酮］正常，精液量>1.5 mL，精子濃度>15×106/mL，總活力>40%，正常形態(tài)>4%，DFI<25%。排除標(biāo)準(zhǔn)：①女方獲卵數(shù)小于5個(gè)；②附睪、睪丸取精患者；③少弱精子癥患者；④泌尿系感染、精索靜脈曲張患者；⑤男方遺傳學(xué)檢查異常的患者；⑥男方近3個(gè)月有危險(xiǎn)化學(xué)品、放射性物質(zhì)接觸史，近3個(gè)月進(jìn)行抗氧化、抗炎治療。本研究是隨機(jī)對(duì)照雙盲試驗(yàn)，并進(jìn)行了嚴(yán)格的分配隱藏，通過(guò)計(jì)算機(jī)產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)進(jìn)行隨機(jī)化分組。根據(jù)不同精子優(yōu)化處理方法分為浮游組（FY組，采用浮游器法優(yōu)選精子）、密度梯度組（DG組，采用密度梯度離心法優(yōu)選精子）和上游組（SU組，采用上游法優(yōu)選精子）。
三.
研究方法
1.密度梯度法優(yōu)選精子：在錐形離心管底加入 2 mL 90%的sperm grad液（瑞典Vitrolife公司），其上加入2 mL 45%的sperm grad液，最后將2 mL的精液加在梯度的上面，離心760×g 15 min，沉淀物用G-IVF plus（瑞典Vitrolife公司）連續(xù)懸浮并離心2次，每次離心380×g 5 min，最后在沉淀中加入受精液，并調(diào)整精子濃度為5×106/mL用于受精。
2.上游法優(yōu)選精子：在15 mL錐形離心管內(nèi)加入2 mL G-IVF plus，將精液緩慢加入到培養(yǎng)液的下層，傾斜45°放置培養(yǎng)箱中孵育60 min。小心吸取上清液，于另一個(gè)15 mL錐形離心管中，380×g離心5 min，棄上清，保留底部沉淀。0.5 mL G-IVF plus液重懸精子沉淀團(tuán)，調(diào)整精子濃度為5×106/mL用于受精。
3.精子浮游器優(yōu)選精子：浮游器的制作材料聚丙烯（青島瑞柏生物股份有限公司），由15 mL的圓底試管和內(nèi)部的浮游通孔組成，浮游通孔直徑6 mm，通孔外圍是凹槽。取1 mL G-IVF plus加入浮游器的底部，將1 mL的精液緩慢加入到培養(yǎng)液下層，上層液面剛好超過(guò)粉紅色的浮游通孔的上緣，使凹槽內(nèi)充滿液體，置于45°傾角的配套試管架內(nèi)于5% CO2、36 ℃的培養(yǎng)箱中孵育30~60 min，精液中活力好的精子首先通過(guò)浮游通孔上游到凹槽中，輕輕吸取凹槽中的精子，調(diào)整精子濃度為5×106/mL用于受精（圖1）。
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4.精子DNA碎片檢測(cè)：根據(jù)試劑盒的操作說(shuō)明書（深圳博銳德生物科技有限公司），新鮮精液用PBS調(diào)制濃度5×106/mL，加入低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠室溫下混均，加20 μL精子凝膠混合液于處理載玻片上，4 ℃水平放置5 min。放入酸性DNA變形液中，室溫孵育7 min。浸泡于裂解液中20 min。洗去殘留液，依次放入70%、90%和99.9%乙醇中各2 min脫水。曬干后玻片用瑞氏染色液，流水沖洗、曬干。詳細(xì)步驟參見文獻(xiàn)［6］。在顯微鏡下對(duì)每個(gè)樣品評(píng)估200個(gè)精子，小光暈或無(wú)光暈的精子被認(rèn)為含有碎裂的DNA。
5.透射電子顯微鏡標(biāo)本制備：上述三種方法處理前、后的精子與來(lái)自同一女性卵泡液的顆粒細(xì)胞塊共同孵育，使精子吸附在顆粒細(xì)胞塊上，將顆粒細(xì)胞塊放于2.5%戊二醛溶液中固定4 ℃過(guò)夜，電子顯微鏡標(biāo)本制作過(guò)程如文獻(xiàn)所述［7］。標(biāo)本在Leica EM UC 7型超薄切片機(jī)中切片，獲得的切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液染色后，在Hitachi H-7650型透射電子顯微鏡下觀察，每個(gè)樣品評(píng)估100個(gè)精子，重復(fù)觀察3遍。
6.控制性促排卵和IVF：控制性促排卵按本科室操作常規(guī)進(jìn)行［8］，促排卵過(guò)程中，當(dāng)有≥2個(gè)卵泡直徑≥18 mm時(shí)，當(dāng)晚肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG，浙江仙琚制藥廠）5000~10 000 IU，hCG注射36 h后行陰道超聲引導(dǎo)下取卵術(shù)，hCG注射后40 h常規(guī)受精。受精后16~20 h觀察到2個(gè)原核為正常受精。胚胎在6% CO2、5%O2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在第3日（day 3， D3）的胚胎根據(jù)2011年美國(guó)、歐洲生殖與不孕協(xié)會(huì)提出的分級(jí)進(jìn)行評(píng)分［9］。除因黃體期促排卵、高孕激素狀態(tài)下促排卵方案、胚胎移植日孕酮水平高、輸卵管積水、內(nèi)膜不適合移植的患者行全部胎冷凍保存外，其余的患者進(jìn)行新鮮胚胎移植。本中心卵裂期胚胎冷凍標(biāo)準(zhǔn)：D3卵裂球數(shù)7~9個(gè)，Ⅰ~Ⅱ級(jí)胚胎，剩余的胚胎行囊胚培養(yǎng)，囊胚的評(píng)分依據(jù)Gander分級(jí)法［10］。囊胚冷凍標(biāo)準(zhǔn)：選擇D5或D6的3期以上，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或滋養(yǎng)層評(píng)分為B級(jí)以上的囊胚。優(yōu)質(zhì)囊胚的形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是D5或D6的3期以上，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層評(píng)分為B級(jí)或A級(jí)的囊胚。
7.凍融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET）方案：采用激素替代人工周期、自然周期和促排卵周期準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜，當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8 mm，口服地屈孕酮（達(dá)芙通，美國(guó)雅培）30 mg/d使子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化為分泌期，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化3~5 d進(jìn)行解凍胚胎移植，移植后給予黃體支持。
8.妊娠判斷：胚胎移植后14 d查尿hCG陽(yáng)性、血hCG>30 IU/L者為生化妊娠；胚胎移植后28~30 d經(jīng)陰道超聲檢查，宮腔內(nèi)見孕囊者為臨床妊娠。
觀察指標(biāo)
主要觀察指標(biāo)：DFI=核DNA碎裂精子數(shù)/精子總數(shù)×100%，精子頭部膜完整率=精子膜不完整個(gè)數(shù)/精子總數(shù)×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；次要觀察指標(biāo)：種植率=B超下見孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，本研究計(jì)量資料均符合正態(tài)性分布，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析進(jìn)行差異比較，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，三組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
男方精液處理前后精子參數(shù)
經(jīng)篩選共有300對(duì)夫婦納入研究，每組各100對(duì)，F(xiàn)Y組、DG組、SU組男方年齡分別為（30.68±3.35）歲、（30.96±3.69）歲和（31.47±4.33）歲，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。精液處理前后三組男方精子濃度、活率、前向運(yùn)動(dòng)精子的比例、正常形態(tài)精子比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且各組內(nèi)部處理前后差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。精液處理后三組精子DFI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02），F(xiàn)Y組精子DFI顯著低于DG組（P=0.03）和SU組（P=0.02），DG組與SU組之間精子DFI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.06）。詳見表1。
透射電子顯微鏡分析精子超微結(jié)構(gòu)
正常的精子細(xì)胞膜完整并連續(xù)，頂體內(nèi)容物均質(zhì)，頂體內(nèi)外膜清晰，核膜完整，細(xì)胞核密度較高，染色質(zhì)均勻。精子頭部異常包括精子膜腫脹、精子核空泡、質(zhì)膜破裂、頂體內(nèi)外膜腫脹/崩解，結(jié)構(gòu)模糊，頭部畸形。FY組精子頭部正常比例較DG組、SU組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01），SU組精子頭部異常比例低于DG組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.15）。FY組精子尾部異常比例（包括線粒體、中心粒、微管的損傷）較其他兩組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.03），F(xiàn)Y組精子尾部異常比例較SU組降低，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.21），三組異常精子頂體反應(yīng)比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.25），三組頂體損壞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.41），詳見圖2、表2。
精子處理方法對(duì)IVF-ET結(jié)局的影響
三組共納入300個(gè)取卵周期，每組各100個(gè)，三組患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)、血抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表3）。三組患者不孕類型構(gòu)成比、控制性促排卵Gn用量和Gn使用時(shí)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）?；颊叩氖芫?、卵裂率三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。FY組的優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎率和囊胚形成率高于其他兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。三組患者的平均移植胚胎數(shù)、平均移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。新鮮周期FY組的妊娠率和植入率明顯高于DG組、SU組（P<0.05），三組患者的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案構(gòu)成比、平均移植胚胎數(shù)、平均移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、子宮內(nèi)膜的厚度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。復(fù)蘇周期FY組的妊娠率和植入率明顯高于其他兩組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），三組患者的流產(chǎn)率、異位妊娠率、雙胎率及移植周期的分娩率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表3、表4）。
本研究第一次采用自然、無(wú)損傷的浮游器法優(yōu)選精子，浮游法類似但不同于精子遷移沉淀技術(shù)，后者使用內(nèi)含一錐形的特制玻璃或塑料管，使精子在1 h或更長(zhǎng)的時(shí)間從液化精液上游到1 mL的上層培養(yǎng)液中，隨后再沉淀到內(nèi)部的錐形管的過(guò)程。而浮游法是使用商品化的浮游管和配套的試管架，浮游時(shí)傾斜45°，增加了精液與上層培養(yǎng)液的接觸面，另外本方法浮游到上層的精子即進(jìn)入到0.3 mL的凹槽內(nèi)，無(wú)需沉淀過(guò)程，縮短上游的時(shí)間，減少精液液化后的精漿接觸培養(yǎng)液可能引起的精子DNA損傷。浮游法也不同于上游法和密度梯度法，其優(yōu)選精子過(guò)程不需要離心和數(shù)次洗滌，篩選精液中即能克服重力又能跨過(guò)浮游通孔的上緣進(jìn)入凹槽的精子用于IVF。早期精液處理的目的是獲得活力、形態(tài)良好的精子，但隨著ART的發(fā)展，特別是引入卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）技術(shù)后，精子優(yōu)選的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到分離獲取功能“健康”的精子用于受精，透射電子顯微鏡對(duì)精子形態(tài)的超微結(jié)構(gòu)分析比光學(xué)顯微鏡更能準(zhǔn)確地檢測(cè)精子的異常，更精確地評(píng)估精子處理方法的安全性和有效性。精子質(zhì)膜組成成分和完整性對(duì)其質(zhì)量十分重要，功能完整的質(zhì)膜是精子能夠進(jìn)行新陳代謝，完成獲能和頂體反應(yīng)，以及與透明帶結(jié)合并穿過(guò)透明帶的基礎(chǔ)。精子的質(zhì)膜也是最容易損傷的部位。本研究顯示，F(xiàn)Y組處理后精子頭、尾部超微結(jié)構(gòu)損傷比例較DG組和SU組明顯降低（P<0.05）。文獻(xiàn)報(bào)道精子質(zhì)膜破裂、膜蛋白分子變性，不能與卵細(xì)胞相互吸引，會(huì)導(dǎo)致精卵識(shí)別障礙對(duì)受精過(guò)程產(chǎn)生負(fù)面影響［11］。但本文中三種方法優(yōu)選的精子與卵子受精后三組之間受精率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Wael等［12］報(bào)道頂體內(nèi)能夠溶解透明帶的頂體素可能與頂體內(nèi)膜有關(guān)，一定程度的精子質(zhì)膜和頂體外膜的腫脹和破裂，只要頂體內(nèi)膜和尾部中段未丟失，頂體素的活性就可能存在，精子仍具有使卵子受精的能力，但可能對(duì)胚胎發(fā)育造成影響。本研究中DG組和SU組處理后精子表現(xiàn)為精子質(zhì)膜和頂體外膜的損傷，精子尾部中段的損傷為線粒體和中心粒細(xì)胞器的損傷，并未表現(xiàn)為中段的丟失，因此可能對(duì)受精的影響并不明顯。本研究對(duì)象不孕的指征為單一女性因素所致，而男方生育力未見異常。文獻(xiàn)報(bào)道離心對(duì)不育患者和生育力正常男性的精液影響結(jié)果不同，生育力正常男性的精液可耐受一定范圍的離心力或只造成輕微的損傷［13］。因此，本研究的結(jié)果可能是樣本選擇的原因掩蓋了三組患者精子超微結(jié)構(gòu)的損傷程度及對(duì)受精的影響。Dutta等［14］報(bào)道，精子離心是機(jī)械性的剪切力，可引發(fā)精子膜一連串的反應(yīng)，最終導(dǎo)致膜脂質(zhì)過(guò)氧化，其中幾乎60%的膜脂肪酸丟失，膜流動(dòng)性降低，增強(qiáng)非特異性滲透離子，也抑制膜受體和酶的作用，甚至終止都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的精子功能障礙，蛋白質(zhì)組學(xué)以及基因組水平的改變。研究也證明精子尾部細(xì)胞器的損傷可導(dǎo)致受精及早期胚胎發(fā)育的異常［15］。接下來(lái)我們將會(huì)觀察離心對(duì)不同質(zhì)量不同來(lái)源的精液膜和超微結(jié)構(gòu)的影響。
精子染色體結(jié)構(gòu)的完整性是評(píng)估精子質(zhì)量的獨(dú)立指標(biāo)。精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性是成功受精和胚胎正常發(fā)育的必備條件。大量文獻(xiàn)證實(shí)精子DNA損傷可能與ART治療結(jié)局相關(guān)，與流產(chǎn)率和部分后代疾病發(fā)病率呈正相關(guān)［16-17］。本研究對(duì)比三組處理后精子DNA的完整性發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Y組優(yōu)化后精子DFI明顯低于DG組和SU組（P<0.05），提示浮游法處理精液可降低處理過(guò)程對(duì)精子核DNA的損傷。目前常規(guī)使用的精液處理方法對(duì)精子超微結(jié)構(gòu)的損傷已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，Simon等［18］的研究顯示密度梯度法處理精子的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致精子DNA碎片率增加。Aitken等［19］使用不連續(xù)的硅膠體梯度制備精子時(shí)，發(fā)現(xiàn)處理后可精子DNA損傷增加。Muratori等［20］報(bào)道90例行ART治療的夫婦使用密度梯度法處理精液，處理后檢測(cè)精液中DNA碎片水平，其中41例患者處理后精液中DNA碎片水平較處理前升高（A組）。49例患者處理后精液中DNA水平較處理前降低（B組），胚胎移植后兩組的妊娠率分別為17.1%和34.4%（P<0.05）。這項(xiàng)研究表明密度梯度法使大約一半受試者處理后DFI增加，并顯示出更低的妊娠概率，總之目前的文獻(xiàn)均提示應(yīng)引起對(duì)這一精液處理程序的安全性的擔(dān)憂。并認(rèn)為在IVF/ICSI中DFI可作為妊娠結(jié)局的一個(gè)新的預(yù)后參數(shù)［21］。
既往的研究多通過(guò)精子的活力、形態(tài)、回收率等評(píng)估精液處理方法的有效性。很少關(guān)注其對(duì)受精及胚胎發(fā)育、囊胚形成及妊娠結(jié)局等方面的影響。本研究比較了三組患者的輔助生殖治療情況，結(jié)果顯示FY組D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率顯著高于DG組和SU組（P<0.05），新鮮胚胎移植周期FY組的臨床妊娠率與植入率明顯高于DG組和SU組（P<0.05），解凍胚胎移植周期結(jié)果與新鮮周期一致。以上結(jié)果提示FY組的胚胎具有較好的發(fā)育潛能。推測(cè)可能歸因FY組對(duì)精子損傷小，獲得的精子質(zhì)量高。文獻(xiàn)報(bào)道胚胎基因組在第二次減速分裂后開始表達(dá)，精子質(zhì)量對(duì)胚胎基因組的貢獻(xiàn)非常重要，對(duì)囊胚發(fā)育的影響尤為明顯［22］。我們的囊胚植入前遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果也初步證明了這一觀點(diǎn)，本研究三組患者囊胚通過(guò)比較遺傳基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）技術(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)FY組的囊胚整倍體率高于密度梯度組和上游組。由于病例少，本部分?jǐn)?shù)據(jù)暫未發(fā)表。
綜上，本研究結(jié)果表明，浮游器優(yōu)選精子是模擬體內(nèi)精子自然選擇機(jī)制，不經(jīng)歷離心過(guò)程，富集精子所需時(shí)間短，可降低液化后精漿與培養(yǎng)液接觸可能引起精子DNA損傷，該方法無(wú)創(chuàng)且費(fèi)用低廉，操作過(guò)程簡(jiǎn)便只需一人一管，減少目前胚胎實(shí)驗(yàn)室精液處理過(guò)程中多次操作和雙人核對(duì)環(huán)節(jié)，避免不同精液混淆的風(fēng)險(xiǎn)，在當(dāng)前胚胎培養(yǎng)室工作人員超負(fù)荷工作的情況下，無(wú)疑是勞動(dòng)力的巨大解放，而且最終提高了不孕患者輔助生殖治療的效率，但鑒于目前數(shù)據(jù)量少，尚需擴(kuò)大樣本深入研究總結(jié)。
本文來(lái)源：中華生殖與避孕雜志
經(jīng)與曹曉敏博士溝通確認(rèn)，文中使用的精子浮游器為我公司【瑞柏生物（中國(guó)）股份有限公司】自主研發(fā)專利產(chǎn)品——輔助生殖用精子浮游管。特此聲明！
