指南概述
體外受精胚胎移植（IVF-ET）技術已在我國大陸地區(qū)發(fā)展27年，近15年來，該項技術迅速成長，大批生殖中心在各地陸續(xù)建成。2001～2003年，衛(wèi)生部主管部門頒布了一系列針對輔助生育技術的技術規(guī)范及管理辦法，使得該項技術走向規(guī)范化，得到健康發(fā)展。2005年12月，中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學分會（CSRM）成立，進一步促進了該學科的學術發(fā)展。
近些年來，中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學分會各方面專家在臨床、實驗室方面均積累了豐富的經(jīng)驗，形成了獨特的見解。為了進一步規(guī)范IVF實驗室操作，為患者提供更優(yōu)質(zhì)的臨床醫(yī)療服務，學組根據(jù)國內(nèi)外發(fā)表的文獻和國內(nèi)實驗室專家意見，并參考了美國生殖醫(yī)學協(xié)會和歐洲生殖醫(yī)學會的相關指南，制定本指南。
由于專業(yè)的特點，目前國內(nèi)外的臨床胚胎實驗室相關指南大量觀點證據(jù)級別均較低，或者無循證證據(jù)。因此按照CSRM指南共識編寫手冊的分類，本指南為正式的專家共識指南。
本指南的適用范圍為我國已經(jīng)正式實施IVF-ET技術的生殖中心，在為不育患者實施IVF-ET治療中，臨床胚胎學家進行的人類配子和胚胎操作。制定本指南的目標是協(xié)助各個實驗室制定自己的標準操作程序，從而獲得更加穩(wěn)定的臨床結局，減少差錯發(fā)生。
IVF-ET實驗室操作的關鍵問題
一、配子與胚胎的總體操作原則
IVF實驗室內(nèi)負責管理工作的臨床胚胎學家，應該針對所有配子或胚胎進行的操作制定標準操作程序，并應該按照該標準操作程序培訓下級臨床胚胎學家。
所有操作方法應該簡便、安全、可靠。胚胎培養(yǎng)室還應遵循無菌、無毒、無味、無塵的原則。
新裝修胚胎培養(yǎng)室啟用前需要做鼠胚試驗，鼠胚試驗合格后才能投入使用。胚胎培養(yǎng)室還應該有UPS電源，以保障24h不間斷供電。
除冷凍復蘇等特定操作外，操作與觀察過程應該保持配子或胚胎處于37℃的溫度、40％～60％濕度的環(huán)境下。
IVF實驗室內(nèi)的空氣質(zhì)量情況會明顯影響胚胎的發(fā)育潛能，建議采取適當?shù)拇胧└纳茖嶒炇业目諝赓|(zhì)量，特別是能夠去除空氣中VOC的凈化系統(tǒng)。
所有操作應該符合無菌原則；所有配子或胚胎操作應該在百級潔凈區(qū)域內(nèi)進行。
所有配子或胚胎的培養(yǎng)皿、試管等應該在放入配子或胚胎前標注患者姓名。不應該在同一操作區(qū)域內(nèi)同時操作兩位或多位患者的配子或胚胎。應該將一位患者的樣本完全處理完并放置入培養(yǎng)箱或液氮容器后再處理下一位患者的樣本。不同的容器間轉(zhuǎn)移配子或胚胎前，應該核對兩個容器上的患者姓名標識。
所有接觸患者配子或胚胎的耗材、試劑需要經(jīng)過精子存活實驗后方可使用，有條件者建議進行鼠胚試驗。
所有接觸患者配子或胚胎的耗材（培養(yǎng)皿、巴斯特管、吸管、加樣器頭、取卵針、移植管等），只能一次性使用，使用后按醫(yī)用垃圾處理。
對配子或胚胎進行的操作時應該進行雙人復核。
具體的每一步操作過程，應該有紙質(zhì)和電子記錄保存，以備日后查驗。
詳細記錄每個病人所用的試劑、耗材批號。
二、取卵及撿卵
IVF實驗室的胚胎學家在取卵前應與臨床醫(yī)生核對患者信息，在臨床醫(yī)師對患者實施取卵術時，應該同步進行撿卵操作。
由于卵母細胞在長時間處于低于體溫的環(huán)境下受精能力將下降，非整倍體幾率增加，因此，在取卵過程中，應從患者卵巢內(nèi)抽出的卵泡液應由負壓吸引器直接吸入37℃恒溫試管架上的無菌試管中。取出的卵泡液應該保持在37℃左右的環(huán)境下，盡快在體視鏡下識別卵冠丘復合物，通過輕柔吹打、洗滌的方法去除卵冠丘復合物周圍的血液、血凝塊和卵泡液成分。
以盡可能減少開啟培養(yǎng)箱次數(shù)、盡可能縮短在培養(yǎng)箱外停留時間為原則，將卵冠丘復合體移至培養(yǎng)箱，記錄所用培養(yǎng)液批號、取卵者及揀卵者姓名、培養(yǎng)箱號、卵冠丘復合物形態(tài)評估情況以及撿卵核對者的姓名等。
三、精液處理
所有患者夫婦在進行IVF治療之前，應該進行精液常規(guī)分析，分析推薦采用WHO第5版的標準。
除特殊情況外，男性配偶應該在取卵前2-7d排精一次。精液收集在無菌、無毒性的取精杯中，并在取精杯上注明患者夫婦姓名及編號。取精后盡快將取精杯送入精液處理室，建議在1h內(nèi)開始處理。
精液處理應該在室溫下進行。精液處理的目的是去除精漿以及精液中的污染物、雜質(zhì)和異常精子，并使精子獲能。精液處理過程中應該記錄取精方法、精液的量、顏色、液化情況等基本參數(shù)。如院外取精，或者在采集精液過程中發(fā)生特殊情況，應該予詳細記錄。
目前暫無統(tǒng)一的精液處理方法，可根據(jù)各中心經(jīng)驗和精液樣本質(zhì)量選擇優(yōu)選方法。不管采用何種方法，反復長時間離心可能會導致精子的損傷。
處理過程（每步時間、操作者等）及處理后的精子濃度、活率，應該記錄備案。
常用精液處理方法為密度梯度離心法或上游法，但對濃度極低的精液樣本，建議僅洗滌1-2次后備用，以卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）方式授精。
1.液化不良精液處理：對液化不良的精液，建議在離心前，用無菌注射器吹吸混勻，或巴氏吸管反復吹打混勻，混勻后讓未液化團塊自然沉淀后棄去，再對樣本進行密度梯度離心。
2.上游法：上游法處理精液，推薦直接將原精液樣本置于培養(yǎng)基下層，收集上層懸液。不建議先與培養(yǎng)基混勻離心后再上游的處理方式。
3.密度梯度離心法：相對上游法處理精液，密度梯度離心處理后精子的回收率較高。上游法和密度梯度離心法都會顯著降低凋亡精子的比例。
四、自然受精
1.自然受精的加精時間：HCG注射后38-40h加精，受精率較為理想。加精時應該雙人核對并記錄時間、加精量。
加精濃度在很大的一個范圍內(nèi)，獲得的受精率類似，在30-50ul的液滴內(nèi)加精5000-10000條，或在1ml的培養(yǎng)液內(nèi)加精15萬-30萬條。但過高的加精濃度可能導致多精受精率升高和培養(yǎng)體系生化環(huán)境下降，因此可能有害。
2.精卵共培養(yǎng)時間：常規(guī)受精：將精卵共培養(yǎng)18-20h；短時受精：縮短精卵共培養(yǎng)至1-6h（短時受精僅指縮短共培養(yǎng)時間，不包括剝除卵冠丘復合物的顆粒細胞）。
短時受精縮短了精子與卵母細胞共培養(yǎng)的時間，能夠改善臨床妊娠率。短時受精周期中，多原核發(fā)生可能與患者年齡有關。短時受精周期中，多原核發(fā)生率對臨床妊娠結局的影響尚不明確。與常規(guī)受精相比，短時受精的可移植胚胎率及優(yōu)質(zhì)胚胎率更高。
五、ICSI
ICSI適應癥：除了原衛(wèi)生部頒布的《衛(wèi)生部關于修訂人類輔助生殖技術與人類精子庫相關技術規(guī)范、基本標準和倫理原則的通知》中的適應癥之外，對于前次IVF多精受精比例較高、沒有獲得足夠可移植胚胎的患者，再次治療可以考慮ICSI。
解凍睪丸精子行ICSI，能得到與新鮮睪丸精子類似的受精結局。
ICSI之前需要用透明質(zhì)酸酶和機械的方法去除顆粒細胞，在此過程中，應該盡量減少卵子接觸酶的時間，機械去除顆粒細胞的過程中應該使用適當口徑的巴斯特管，盡量減少吹吸次數(shù)，從而減少機械刺激的應激。
透明帶明顯異常的卵母細胞自然受精能力下降，采用ICSI方式授精能明顯改善受精結局 。
在經(jīng)過常規(guī)卵巢刺激后，獲得的未成熟卵母細胞常常存在染色體異常，未表明對這些卵進行ICSI能改善結局 。如經(jīng)過卵巢刺激獲卵均為MI期停滯的卵細胞，行體外成熟培養(yǎng)（IVM）結局不良 。
HalfICSI：部分卵子ICSI（HalfICSI）作為可疑受精困難者的備選，在一定程度上預防IVF完全受精失敗。
ICSI操作過程中，可以考慮采用PVP等液體來降低操作難度，但要盡量減少注入卵母細胞的PVP的量。
影響ICSI受精率的最重要的因素包括：卵母細胞的質(zhì)量和成熟度、精子質(zhì)量及制動情況、破膜的情況。
在操作人員技術熟練的基礎上，受精率低或卵母細胞退化率高的最可能原因是卵母細胞的質(zhì)量差或成熟度不良 。應該盡一切可能選擇活動精子制動后注射，制動過程如果不充分（未劃破精子尾部細胞膜）將影響受精率。
如全部精子均為不動精子，可以考慮在ICSI操作中使用睪丸精子、經(jīng)低滲處理的精子或者在精子中加入精子激動劑 ICSI后應該在記錄中記錄卵母細胞和精子的情況、操作過程、操作者、所用培養(yǎng)液及耗材詳情。
六、早期補救性ICSI
短時受精結合早剝除卵冠丘復合物顆粒細胞（早拆卵），以極體排出（卵子激活）判斷受精發(fā)生，如卵子激活完全失敗或卵子激活發(fā)生率低于一定比例時，在加精時間短于8h行補救ICSI稱早期補救ICSI。
短時受精（早拆卵）聯(lián)合早期補救性ICSI對常規(guī)IVF周期完全受精失敗患者的臨床結局有明顯改善 ，早期補救ICSI后妊娠的出生結局及新生兒狀況與采用射精精液的ICSI后出生結局無統(tǒng)計學差異 。早期補救性ICSI周期出生嬰兒的性別比無偏差，出生體重正常，無嚴重出生缺陷 。但目前還缺乏長時間的隨訪的結果，因此臨床醫(yī)生可以考慮對這類患者進行短時受精聯(lián)合早期補救性ICSI。
七、胚胎培養(yǎng)
常規(guī)受精結束或ICSI后應該更換培養(yǎng)液及培養(yǎng)皿，隨后在IVF授精或ICSI后16-18h之間觀察受精情況，記錄原核形態(tài)、數(shù)量。
胚胎培養(yǎng)時間點設置：根據(jù)2011年版ESHERE發(fā)布的Istanbul共識 設置胚胎觀察時間點（表1）。由于各實驗室培養(yǎng)體系不同、操作方法不同，胚胎發(fā)育速度不一致。因此，學組建議各中心應在Istanbul共識的時間點基礎上找出符合各自中心最佳觀察點。
雖然多原核的胚胎依然有繼續(xù)發(fā)育甚至妊娠的可能性，但多原核胚胎有導致滋養(yǎng)細胞疾病的可能，不應該用于移植和冷凍 。
人類胚胎對外部應激非常敏感，不良應激會導致細胞代謝異常，影響細胞功能和基因表達 。因此，胚胎體外培養(yǎng)的核心工作應該著眼于使胚胎時刻保持在合適的pH值、溫度、滲透壓等指標的環(huán)境中，以利于胚胎保持穩(wěn)態(tài) 。
胚胎的觀察應該注意卵裂球數(shù)量、碎片所占的百分比、細胞大小的均一性及排列、胞漿顏色以及多核現(xiàn)象等。推薦參考Istanbul共識中的胚胎評分方法，針對每一枚卵裂期胚胎，形態(tài)學評分應包含三個方面信息：卵裂球數(shù)、級別以及評為這個級別的原因。Istanbul共識中級別的評見表2。
胚胎培養(yǎng)記錄中應詳細記載所用培養(yǎng)液的品種、批號、培養(yǎng)箱的情況、操作人員等詳情。
八、胚胎移植
1.移植胚胎數(shù)目：我國衛(wèi)生行政部門已經(jīng)有明確的法規(guī)限制了移植胚胎的數(shù)量 ，但是對于瘢痕子宮、雙子宮等畸形子宮、宮頸內(nèi)口松弛、身高過于矮小等高?；颊?，移植２枚胚胎將會對母嬰造成很大的安全風險，建議進行單胚胎移植。
2.移植胚胎選擇：相對而言，卵裂球數(shù)量比卵裂球均一情況及胚胎碎片含量更能預測胚胎的發(fā)育能力；散在的胚胎碎片比集中的胚胎碎片更加影響胚胎著床；卵裂球內(nèi)是否存在多核現(xiàn)象顯著影響胚胎的著床率 。除了形態(tài)學選擇外，測定胚胎的氨基酸代謝情況等生化檢測指標 、胚胎分泌的微量HCG等方法，也可以考慮作為一種無創(chuàng)選擇胚胎的手段。
3.移植方法：應該使用一次性移植導管。超聲引導下移植使手術更加精準，并保證穩(wěn)定的妊娠率 。在裝載移植管時務必雙人核對，在將含胚胎的移植管置入患者宮腔之前，應該雙人核對患者姓名 。
4.移植記錄：移植記錄應該詳細記載胚胎數(shù)目、形態(tài)學評分、移植時間、移植過程中導管置入深度、出血的情況、以及臨床醫(yī)師和臨床胚胎學家的姓名。
九、囊胚培養(yǎng)
囊胚培養(yǎng)的主要目的是對胚胎進行自然選擇。對于部分患者而言，囊胚培養(yǎng)移植可能改善她們的臨床妊娠率 。囊胚培養(yǎng)可以等待PGD結果出具，利于篩選移植胚胎。囊胚培養(yǎng)增加了胚胎在體外的培養(yǎng)時間，也增加了不利因素影響的風險 。
由于囊胚的營養(yǎng)需求與卵裂期胚胎有差異，因此囊胚培養(yǎng)過程中通常采取一些特殊的條件。目前較多采用序貫培養(yǎng)液進行囊胚培養(yǎng)，但這并非唯一方案。另外低氧培養(yǎng)、集合培養(yǎng)也有可能利于囊胚形成。如果進行囊胚培養(yǎng)，應該具備良好的培養(yǎng)條件。
目前大多數(shù)中心按照Gardner囊胚分級法對形成的囊胚進行分級 。在此基礎上，為了消除工作人員之間在評分方法上的差異，推薦采用更為細化和客觀化的評分手段：擴張之后的囊胚因為囊胚腔明顯擴大，內(nèi)細胞團與滋養(yǎng)層清晰，而且囊胚在此階段發(fā)育的時間較長，因此在此發(fā)育階段進行形態(tài)學評分更客觀可靠；可以在擴張囊胚的中部最大直徑平面（“赤道面”）上以及囊胚最貼近培養(yǎng)皿的底面上分別聚焦后觀察滋養(yǎng)細胞和內(nèi)細胞團。細化的擴張囊胚形態(tài)學評分標準見表３。
雖然滋養(yǎng)細胞層將來并不發(fā)育成胎兒，但其形態(tài)對于囊胚的進一步發(fā)育和著床有著非常重要的意義 。D5和D6形成的囊胚均可進行移植或冷凍，D5的囊胚著床率高于D6的囊胚。
不同來源的精子受精后的胚胎，形成囊胚的比例和質(zhì)量可能存在差異 。D3的優(yōu)質(zhì)胚胎，囊胚形成率較高，而且囊胚質(zhì)量較好 。
囊胚培養(yǎng)移植可能會增加移植取消率。
囊胚培養(yǎng)記錄中應該包含培養(yǎng)箱、培養(yǎng)液的情況，并記錄囊胚形成的時間。
十、配子及胚胎冷凍
每個生殖中心實驗室均應該建立可靠的冷凍保存技術，冷凍過程及放入液氮灌的儲存位置時應雙人核對。
冷凍方法：雖然玻璃化冷凍技術中采用的冷凍保護劑濃度更高，可能帶來胚胎毒性的風險，但玻璃化冷凍的卵母細胞、卵裂期胚胎和囊胚復蘇率均明顯優(yōu)于程序冷凍技術 。且從目前國內(nèi)外獲得的短期隨訪數(shù)據(jù)看來，玻璃化冷凍復蘇的胚胎，移植后出生的新生兒，出生缺陷無明顯增加，身長體重也未見明顯異常 。因此推薦采用玻璃化冷凍技術進行胚胎的冷凍。
卵母細胞冷凍：目前卵母細胞冷凍技術上不完全成熟，效率較低，建議僅用于因醫(yī)學原因無法在取卵日受精的患者。HCG后36h取卵，取卵后2h玻璃化冷凍卵母細胞的復蘇率顯著高于取卵后5-6h冷凍的卵母細胞，因此建議在取卵后2h左右進行冷凍 。
冷凍復蘇后的卵母細胞，紡錘體在2-3h重建，線粒體的膜電位2h后恢復 ，因此建議在復蘇2-3h后進行ICSI。
胚胎冷凍：移植剩余的胚胎，可以考慮按照一定的質(zhì)量標準選擇后，進行胚胎冷凍。發(fā)育速度過慢或質(zhì)量太差的胚胎，不論是卵裂期胚胎還是囊胚，其復蘇后存活率和著床率都會顯著降低。每個冷凍容器內(nèi)的胚胎數(shù)量推薦結合擬復蘇移植的胚胎數(shù)量和所在中心的復蘇率來確定 。
玻璃化冷凍液中的平衡時間明顯影響胚胎復蘇率以及復蘇后的發(fā)育能力，平衡時間的長短應該與溫度相適應：溫度越高（37℃），平衡時間越短；溫度較低（“室溫”），平衡時間應該適度延長。擴張較充分的囊胚冷凍復蘇后存活率較好，建議這些胚胎在進行玻璃化冷凍前應進行人工皺縮排出囊胚腔內(nèi)的液體 。
復蘇后胚胎存活的情況，可以根據(jù)胚胎形態(tài)和繼續(xù)培養(yǎng)過程中胚胎發(fā)育情況來綜合判斷。能進一步發(fā)育的胚胎預后良好。卵裂期胚胎，如果復蘇后有部分卵裂球發(fā)生損傷，提示胚胎發(fā)育潛能不良不利于后續(xù)的臨床結局 。
冷凍記錄：應該包括冷凍方法、每個容器內(nèi)的胚胎數(shù)量、發(fā)育階段、形態(tài)學評分、在液氮容器內(nèi)的儲存位置。
為保證冷凍中的配子或胚胎的安全，應該監(jiān)測液氮容器內(nèi)的液氮液面位置，建立完善的冷凍管理制度。
十一、輔助孵出
輔助孵出應用于新鮮周期移植的價值一直存在爭議，目前的證據(jù)不推薦對所有移植的胚胎進行輔助孵出。而對于那些臨床預后較差的患者，如反復植入失敗、胚胎質(zhì)量較差、胚胎透明帶異常的胚胎以及高齡的患者（>38歲），輔助孵出可能改善種植率 。
通過時差成像技術觀察，發(fā)現(xiàn)復蘇胚胎（尤其是復蘇囊胚），輔助孵出后可以利于胚胎的后續(xù)孵出，但對臨床結局是否存在改善尚不明確。目前可以考慮采用激光輔助孵出設備進行胚胎的輔助孵出。
指南總結
一、索引
配子與胚胎的總體操作原則；取卵及揀卵；精液處理；自然受精；ICSI；早期補救性ICSI；胚胎培養(yǎng)；胚胎移植；囊胚培養(yǎng)；配子及胚胎冷凍；輔助孵出
二、簡略說明
IVF實驗室負責人，應該針對所有配子或胚胎操作制定標準操作程序。撿卵時，盡可能縮短卵冠丘復合物在培養(yǎng)箱外停留時間；精液處理方法應根據(jù)精液具體情況而定；自然受精的加精時間為HCG注射后38-40h，受精率較為理想；加精濃度在很大的一個范圍內(nèi)，獲得的受精率類似；
影響ICSI受精率的最重要的因素包括：卵母細胞的質(zhì)量和成熟度、精子質(zhì)量及制動情況、破膜的情況；短時受精（早拆卵）聯(lián)合早期補救性ICSI對常規(guī)IVF周期完全受精失敗患者的臨床結局有明顯改善；胚胎培養(yǎng)和觀察應嚴格按照設定的時間點進行，D3胚胎的卵裂球數(shù)量比卵裂球均一情況及胚胎碎片含量更能預測胚胎的發(fā)育能力；
囊胚培養(yǎng)的主要目的是對胚胎進行自然選擇；雖然滋養(yǎng)細胞層將來并不發(fā)育成胎兒，但其形態(tài)對于囊胚的進一步發(fā)育和著床有著非常重要的意義；玻璃化冷凍的卵母細胞、卵裂期胚胎和囊胚復蘇率均明顯優(yōu)于程序冷凍技術；輔助孵出應用于新鮮胚胎移植的價值一直存在爭議，對復蘇胚胎移植可能改善臨床結局。
三、下一步研究指導、方法學
下一步的研究應該著重于各種操作技術對比的RCT研究，獲得更強的證據(jù)；應考慮到全國范圍內(nèi)環(huán)境、人群和實驗室具體條件的區(qū)別，多中心研究要納入不同地域的中心。